Приготовление красителей для микроскопического исследования

Что такое микроскопический метод исследования?

Приготовление красителей. Красящие растворы готовят из анилиновых красителей. Красители бывают основные (щелочные) и кислые. Кислые красители легко окрашивают элементы клеток, имеющие щелочную реакцию, конкретно протоплазму, поэтому их называют протоплазматическими. Кислые красители бактерий не окрашивают. Употребляют их лишь для прокрашивания фона препарата.

Основные красители окрашивают ядра клеток, поэтому их называют ядерными. Бактерии окрашиваются почти исключительно основными красителями.

Важнейшие основные красители: красные — нейтральрот, пиронин, сафранин, фуксин основной; фиолетовые — генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет, тионин; синие — метиленовая синь, виктория; зеленые — малахитовая зелень, метиловая зелень; коричневые — везувин, хризоидин; черный — индулин.

Главные кислые красители: красные — кислый фуксин, эозин; желтые — ауранция, пикриновая кислота; черный — нигрозин. Красители имеют вид порошков или кристаллов, для окраски микробов из них готовят водные и спиртовые растворы.

Водный раствор кристаллвиолета. К 0,3 г красителя добавляют 100 мл дистиллированной воды, раствор фильтруют. Применяют для окраски по Граму. Раствор не дает осадка.

Водный раствор метилвиолета. Берут 1 г красителя в порошке и растворяют в 100 мл горячей дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр. Окраска по Граму.

Водный раствор нейтральрота. 1 г красителя в порошке растворяют в 100 мл горячей дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр. Окраска по Граму.

Водный раствор сафранина. 2 г краски насыпают на бумажный фильтр и заливают 100 мл горячей дистиллированной воды.

Водные растворы могут медленно, слабо и быстро портиться. Готовить их нужно в небольших количествах, хранить в темных склянках. Для усиления действия красителей применяют протравители: фенол, едкую щелочь, йод, спирт, формалин и другие химические вещества, которые повышают окрашиваемость микробов. Действие протравителей различно. Они или уплотняют протоплазму бактерий, или мацерируют слишком плотную их оболочку, способствуя проникновению красителя (щелочь), или осаждают краситель в протоплазме клетки. Окрашиваемость микробов также повышается при подогревании, повышении концентрации красителя, увеличении времени окрашивания (до нескольких часов).

Спирто-водные растворы красителей применяют чаще, так как они быстро окрашивают микробные клетки и долго сохраняются. Спирто-водные растворы готовят в два приема. Вначале готовят (на 1 год и более) спиртовые насыщенные растворы красителей. Для этой цели к 1 г краски добавляют 9 мл этилового 96%-ного спирта. Из насыщенных спиртовых растворов красителей готовят рабочие спирто-водные растворы. К 1 мл насыщенного спиртового раствора прибавляют 9 мл дистиллированной воды. Для усиления действия краски к дистиллированной воде добавляют какой-нибудь вышеуказанный протравитель. Приготовленные растворы ставят в теплое место (термостат) на 1—2 сут для лучшего растворения краски, после чего фильтруют через плотный бумажный фильтр и лишь тогда применяют для окрашивания мазков.

Феноловый фуксин Циля. К 1 г основного фуксина в порошке приливают 10 мл спирта-ректификата. Смесь оставляют на сутки в комнате для получения насыщенного спиртового раствора фуксина. После этого к насыщенному раствору краски прибавляют 90 мл 5%-ного раствора кристаллического фенола, приготовленного на дистиллированной воде. Через сутки красящий раствор фильтруют через бумажный фильтр и разливают по флаконам. Фуксин Циля — стойкий краситель к сохраняется длительное время. Этот краситель употребляют для окрашивания спор и кислотоупорных бактерий. 2%-ный феноловый фуксин готовят из одной части фуксина Циля и 1,5 части воды; употребляют для окраски мазков из тканей. Вегетативные формы будут ярко-красные, а споры — розовые.

Фуксин Пфейффера готовят из фенолового фуксина Циля: берут одну часть фуксина Циля и разбавляют девятью частями дистиллированной воды. Краситель нестойкий, поэтому его употребляют в свежеприготовленном виде.

Феноловый генцианвиолет. К 1 г генцианвиолета приливают 9 мл спирта-ректификата, смесь оставляют на сутки в комнате для получения насыщенного спиртового раствора красителя. К полученному спиртовому насыщенному раствору генцианвиолета прибавляют 100 мл 2%-ного раствора кристаллического фенола. Через сутки красящий раствор фильтруют через бумажный фильтр и разливают по флаконам. Феноловый генцианвиолет хранится долго. Применяют при окраске микробов по способу Грама.

Метиленовая синь Леффлера. К 3 г метиленблау в порошке приливают 30 мл спирта-ректификата. Смесь оставляют на сутки в комнате для получения насыщенного спиртового раствора красителя. После этого к полученному насыщенному раствору сини приливают 100 мл 0,01%-ного водного раствора едкого калия. Через сутки красящий раствор фильтруют.

Раствор Люголя. В 5 мл дистиллированной воды растворяют сначала 2 г йодистого калия, а затем 1 г кристаллического йода. После растворения йода прибавляют 295 мл дистиллированной воды и фильтруют. Готовят раствор для окраски бактерий по Граму.

Приготовление препарата. Предметные и покровные стекла должны быть совершенно чистыми и обезжиренными. Нанесенная на сухое стекло капля воды должна расплываться. Стекла, не бывшие в употреблении, моют, затем кипятят в 1%-ном растворе соды, обмывают водой, Далее 2%-ным раствором соляной кислоты и снова водой. Использованные стекла после кипячения натирают мылом или моют моющим порошком и вытирают насухо марлей. Пипетки пастеровские готовят сами по мере надобности. Для этого стеклянные трубки длиной 20 см моют, сушат, с обоих концов вставляют ватные тампоны и стерилизуют. Затем середину этих трубок сильно нагревают на огне, непрерывно вращая, вытягивают и концы запаивают. Получаются пипетки. При пользовании пипеткой часть тонкого конца обламывают и набирают исследуемый материал.

Пипетки или иглы готовят из платиновой или никелевой проволоки. Проволоку длиной 8—10 см вставляют в специальный иглодержатель или впаивают в конец стеклянной палочки. Петлю готовят путем загиба конца проволоки в замкнутое кольцо диаметром 3 мм. Петлю (иглу) перед взятием материала фламбируют (прокаливают) на огне спиртовки.

Чтобы приготовить препарат, берут обезжиренное стекло и на обратной его стороне делают карандашом надпись номера экспертизы и другие обозначения. Затем на стекло наносят каплю физраствора. После этого захватывают петлей из тканей насекомого или чистой культуры небольшое количество материала и вносят в каплю на стекло. Осторожными круговыми движениями каплю распределяют петлей по стеклу в виде овала. При этом надо следить за тем, чтобы капля солевого раствора только помутнела. Остаток культуры на петле сжигают на пламени спиртовой горелки. Распределять взвесь по стеклу следует весьма осторожно, чтобы не изменить естественного расположения микробов (гроздья, цепочки и пр.). Мазки высушивают при комнатной температуре, а не на горелке, так как при ускоренной отдаче воды микробные клетки деформируются (изгибаются, укорачиваются, обугливаются). Особенно не рекомендуется сушить над пламенем мазки из тканей.

Фиксация препарата на огне. После высушивания препаратов с мазками их фиксируют. Цель фиксации — прикрепить микроорганизмы к стеклу и убить их, т. е. сделать обращение с ними безопасным и создать условия, способствующие лучшей окраске мазка. Наиболее простым способом фиксации мазков является подогревание их на пламени спиртовки. При фиксации пламенем препарат держат большим и указательным пальцами правой руки1 за края стекла у того его конца, где написан номер. Стекло проводят через пламя мазком вверх неторопливыми движениями. При недостаточном нагревании мазок будет плохо зафиксирован и при окрашивании смоется водой. На плохо зафиксированном мазке при нанесении капли масла микробы всплывают, что затрудняет исследование. При перегревании изменяется форма микроба.

Фиксация препарата спирт-эфиром. Более совершенная фиксация достигается погружением мазка в смесь из равных частей этилового спирта и эфира. Можно эту смесь наливать на мазок и держать до испарения. Такая фиксация обычно рекомендуется для мазков из тканей, особенно содержащих микроорганизмы.

Изучение микробов. 1. Освоить методы окраски мазков по Граму, капсул, спор и негативный способ окраски. 2. Исследовать неокрашенные мазки. 3. Освоить способ измерения микроорганизмов.

Оборудование и материалы: микроскопы (по одному на студента); бактериологическая петля, спиртовка, кедровое масло, шесть листков фильтровальной бумаги, банка с обезжиренными стеклами, обезжиренные покровные стекла и восковой карандаш, 2%-ный феноловый раствор генцианвиолета, раствор Люголя, 70%-ный спирт, водный раствор сафранина, щелочной раствор метиленовой сини Леффлера, карболовый фуксин Циля — Нильсена, черная тушь, взвеси бактерий кишечной палочки, стафилококка; расплод, пораженный гнильцом; мертвые пчелы, погибшие от нозематоза; стеклянные банки с 2%-ным раствором фенола для погружения отработанных материалов, таблицы окраски по Граму, окулярный и объективный микрометры.

Методы окраски мазков.Простая окраска. Для окрашивания препаратов используют простые и специальные способы окрашивания. Простая окраска применяется для общего ознакомления с формой, размерами и расположением микроорганизмов. На высушенный и фиксированный мазок наносят с помощью пипетки и резинового баллона несколько капель красителя так, чтобы последний покрывал с избытком весь мазок. Для простой окраски чаще всего употребляют метиленовую синь, сафранин или водный фуксин Пфейффера. Краску держат на препарате 2—3 мин и затем смывают водой. Окрашенные мазки тщательно высушивают между листами фильтровальной бумаги. На совершенно сухой препарат наносят каплю кедрового масла и исследуют под микроскопом через иммерсионный объектив. Формы и расположение микроорганизмов зарисовывают в тетрадь.

Окраска по Граму позволяет делить микроорганизмы на две группы: грамположительные и грамотрицательные, что зависит от химического строения бактерий. Грамположительные бактерии обладают способностью прочно удерживать фиолетовый краситель с йодом и не обесцвечиваться спиртом. Грамотрицательные бактерии при таком способе окраски легко обесцвечиваются спиртом.

Обычно для окрашивания употребляют 2%-ный феноловый раствор генцианвиолета. Нередко его заменяют водным раствором кристаллвиолета или метилвиолета. Мазок красят раствором генцианвиолета или кристаллвиолета 2 мин, избыток красителя сливают. Не промывая водой, наносят раствор Люголя на 2 мин, сливают и обрабатывают 90%-ным спиртом-ректификатом в течение 40—45 с. Спирт смывают водой и дополнительно окрашивают фуксином Пфейффера в течение 2 мин. Мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, наносят каплю кедрового масла и смотрят с иммерсией, Грамположительные бактерии сохраняют фиолетовый цвет, а грамотрицательные окрашиваются в красный цвет.

Окрашивание по Граму сопровождают контролями. На предметное стекло наносят три мазка: из испытуемого материала, грамположительных микробов (стафилококки, сенная палочка) и грамотрицательных микробов (кишечная палочка).

Метод Ольта. Некоторые бактерии вокруг себя образуют капсулу. Для выявления ее мазки красят 2%-ным водным раствором сафранина с подогреванием до охлаждения паров. Раствор сафранина готовят перед употреблением. Красят 3 мин, промывают водой, сушат фильтровальной бумагой, наносят каплю кедрового масла и микроскопируют. Микроорганизмы темно-красные, капсулы желтые. Исследуют мазки, приготовленные от недавно погибших личинок европейского гнильца.

Окраска по Цилю — Нильсену. Не красящиеся обычными красителями так называемые кислотоупорные микроорганизмы, а также споры красят по Цилю — Нильсену. Высушивают мазок, фиксируют, окрашивают феноловым фуксином Циля 1—3 мин, подогревая до появления паров, промывают водой, обесцвечивают 2—5 с до исчезновения розовой окраски 5%-ным раствором серной или 15%-ным раствором азотной кислоты, промывают водой, дополнительно окрашивают метиленовой синью 0,5—1 мин.

Споры и кислотоупорные микроорганизмы окрасятся в красный цвет, обычные бактерии — синий.

Негативная окраска заключается в том, что на окрашенном фоне выделяются неокрашенные микроорганизмы. Этот способ применяют чаще для окраски извитых форм микроорганизмов — спирохет, трипаносом (рис. 6). Для негативной окраски используют черную тушь, кислый фуксин и нигрозин. К 2%-ному водному раствору нигрозина для длительного сохранения добавляют 0,4% хлороформа.

Рис. 6. Спирохетообразные тельца жгутиков Вас. larvae при негативной окраске

Исследование микроорганизмов без окрашивания. Исследование микроорганизмов без окрашивания применяют для выявления их подвижности, а также для изучения некоторых групп микроорганизмов, хорошо различимых без окрашивания, например простейших. Подвижность микроорганизмов изучают в висячей и раздавленной капле.

Висячую каплю готовят на специальных предметных стеклах с лункой. На покровное стекло наносят маленькую каплю суспензии из физраствора и микробов. Эту каплю закрывают предметным стеклом с лункой, вокруг которой предварительно наносят тонкий слой вазелина. Покровное стекло накрывают так, чтобы капля оказалась в центре лунки. Благодаря вазелину покровное стекло прилипает к предметному. После этого предметное стекло перевертывают, и капля оказывается висячей.

Установка висячей капли под микроскопом требует выполнения определенных правил, иначе покровное стекло будет раздавлено объективом. Сначала при слабом увеличении, (с опущенным конденсором и полузакрытой диафрагмой) отыскивают край капли, который ставят в центре поля зрения. В таком положении стекло закрепляют зажимами. После этого на покровное стекло наносят каплю кедрового масла, в которую под контролем глаза опускают иммерсионный объектив до соприкосновения со стеклом, затем, медленно поднимая конденсор и усиливая освещение частичным раскрытием диафрагмы, устанавливают фокус. Край капли позволяет быстрее установить иммерсионный объектив в фокусе.

Раздавленную каплю готовят, накрывая покровным стеклом каплю из смеси физиологического раствора и микробов, помещенную на предметное стекло. На покровное стекло наносят каплю кедрового масла и препарат рассматривают под иммерсионной системой микроскопа при слегка затемненном конденсоре.

При массовых исследованиях с целью выявления крупных микроорганизмов (позема), видимых при малых и средних объективах микроскопа, препараты просматривают без покровных стекол. Приготовленному мазку дают высохнуть при комнатной температуре. Затем перед исследованием наносят каплю раствора, которую сразу же стряхивают на фильтровальную бумагу. Оставшийся на поверхности слой раствора заменяет покровное стекло.

В тех случаях, когда приходится готовить много препаратов для исследования одних и тех же объектов, например исследования взрослых пчел и бабочек тутового шелкопряда на нозематоз (пебрину), применяют особые растирательные машины, значительно ускоряющие процесс приготовления мазков. Ступки установлены в особом металлическом штативе. В них кладут трупы пчел или бабочек. В ступки наливают определенное количество раствора. Штатив ставят под растирательную машину, имеющую столько пестиков, сколько ступок в штативе. Пестики автоматически приводят в движение, а после растирания автоматически поднимают их особым рычагом над ступками. Снизу к ним подносят специальные предметные стекла, по форме соответствующие половине круга штатива. Касаются одним таким стеклом одной половины пестиков машины, вторым — другой. Капли суспензии, имеющиеся на пестиках, при прикосновении стекла образуют мазки. На полиэдры и протозои исследуют мазки без фиксации В этих случаях на влажный приготовленный препарат, не давая ему просохнуть, накладывают покровное стекло и исследуют сначала при слабом, а затем при среднем увеличении микроскопа. В таких случаях мазки исследуют под микроскопом при несколько затемненном и опущенном конденсоре.

 

Рис. 7. Окулярный (а) и объективный (б) микрометры

Рис. 7. Окулярный (а) и объективный (б) микрометры

Измерение микроорганизмов. Для измерения микроорганизмов пользуются окулярным и объективным микрометрами. Окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, в середине которой нанесена линейка длиной 5 мм, разделенная на 50 частей (рис. 7). Из окуляра вывинчивают глазную линзу и кладут на диафрагму окулярный микрометр. Затем глазную линзу завинчивают. Непосредственные измерения микробов производят окулярным микрометром. При различных сочетаниях объективов и окуляров одно деление окулярного микрометра будет различным. Для определения точных размеров деления окулярного микрометра при данном определенном сочетании объектива и окуляра пользуются вспомогательным прибором — объективным микрометром. Он представляет собой стеклянную или металлическую пластинку, имеющую в центре застекленное отверстие. В центре объективного микрометра нанесена линейка длиной 1 мм, которая разделена на 100 частей. Каждое деление равно 10 мкм. На столик микроскопа кладут объективный микрометр и устанавливают его линейку в поле зрения микроскопа при нужном сочетании объектива и окуляра. Затем совмещают объективную и окулярную линейки и определяют, сколько делений вкладывается в то или иное количество делений объективной линейки. Например, в три деления объективной линейки вкладывается пять делений окулярной линейки. Следовательно, одно деление окулярной линейки будет 30:5=6 мкм.

 

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *