Серологическая диагностика болезней пчел

Серологическая диагностика болезней пчел. 1. Изучить реакции преципитации и агглютинации. 2. Изучить диагностику флуоресцирующими антителами.

Оборудование и материалы: специфические сыворотки и контрольные антигены для реакции преципитации и реакции агглютинации, асбестовая вата, маленькие воронки и пробирки (0,55 см.), предметные стекла, раствор, пастеровские пипетки, пипетки градуированные 1 мл, специфические сыворотки, меченные флуоресцином, флуоресцентный микроскоп.

Серологические (serum — сыворотка) реакции основаны на специфичности антигена и антитела. Они имеют большое практическое значение, позволяя по известному антителу, т. е. специфической сыворотке (приготовленной путем иммунизации кролика каким-либо известным эитомопатогенным микробом), определять неизвестного энтомопатогенного микроба и причину гибели насекомого. Для диагностики болезней пчел и шелкопрядов используют наиболее часто следующие серологические реакции: реакцию преципитации, реакцию агглютинации и флуоресцирующие антитела.

Реакция преципитации. Преципитация (precipitatio — быстрое осаждение) представляет собой выпадение белка в осадок при соединении прозрачных сывороток и антигена. Сыворотку берут прозрачную, неразведенную, на которую наслаивают хорошо отфильтрованный прозрачный антиген. Для диагностики американского и европейского гнильца антиген готовят из 10 погибших от гнильца личинок, кладут их в ступку, добавляют туда же десятикратное количество физраствора (15 мл для взрослых личинок и 7 мл для 3—4-дневных личинок). Личинок тщательно растирают, суспензию нагревают на кипящей водяной бане 15 мин и фильтруют через асбестовую вату до получения прозрачного экстракта.

Реакцию преципитации ставят в небольших пробирках диаметром 0,4—0,5 мм и высотой 5—7 см. В одну пробирку наливают небольшое количество (0,3—0,4 мм) прозрачной, хорошо отфильтрованной через асбест специфической сыворотки против американского гнильца (антиларвейная сыворотка), в две другие — специфические сыворотки против европейского гнильца (антиплютоновая и антиальвейная сыворотки), сверху на эти сыворотки осторожно наслаивают прозрачный экстракт. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 15 мин. При положительной реакции образуется, обычно уже спустя 0,5—2 мин, на границе между сывороткой и испытуемым экстрактом тонкое нежное голубовато-матовое кольцо. Реакцию преципитации сопровождают контролями: а) испытуемый экстракт с нормальной сывороткой (должна быть отрицательная реакция); б) со специфическими антигенами (положительная реакция). В том случае, если испытуемый экстракт даст положительную реакцию с антиларвейной сывороткой, ставят диагноз — американский гнилец, если испытуемый экстракт даст положительную реакцию с обеими или с одной из сывороток против европейского гнильца, ставят диагноз — европейский гнилец. При положительной реакции с антиларвейной сывороткой и с одной.или обеими сыворотками против европейского гнильца ставят диагноз — смешанная инфекция европейского гнильца.

Реакция агглютинации. Агглютинацией (agglutinatio — склеивание) называют склеивание бактерий под влиянием специфической сыворотки в присутствии электролитов (солей среды). Реакцию агглютинации ставят, соединяя различные разведения специфической сыворотки (антитела) со взвесью бактерий (антигены). Реакцию ставят в пробирках, в таких случаях учет результатов производят через сутки и на предметном стекле, соединяя каплю разведенной специфической сыворотки и каплю антигена. Учет реакции производят через 3—5 мин. Реакция агглютинации при постановке на стекле в каплях носит название капельной агглютинации.

Капельная реакция агглютинации применяется для диагностики американского гнильца. Для ее постановки из исследуемого образца сота берут 10 погибших личинок, кладут в фарфоровую ступку, добавляют 10 мл физраствора, тщательно растирают, фильтруют через вату, фильтрат подогревают до 80 °С и в горячем виде дополнительно фильтруют через бумажный фильтр, центрифугируют 10—15 мин при 2500 оборотах; жидкость сливают, осадок берут по одной бактериологической петле как испытуемый антиген.

В различные места чистого обеззараженного предметного стекла наносят пастеровской пипеткой две капли антиларвейной сыворотки; одну в разведении 1:200, вторую — 1:400. К ним добавляют по одной петле испытуемого антигена. Реакция протекает при 37 °С. При положительной реакции в течение 3—5 мин происходит полное просветление жидкости и скучивание микробов в виде комочков. Контроля этого микробного антигена с аналогичными разведениями нормальной сыворотки и физраствором не просветляют жидкость и не образуют хлопьев.

Реакцию агглютинации ставят также для быстрого определения энтомопатогенных бактерий. В этих случаях берут определенные специфические сыворотки.

Диагностика флуоресцирующими антителами. Быстрый и точный диагноз бактерийных, риккетсиозных и некоторых других болезней насекомых достигается при исследовании в люминесцентном микроскопе свечения возбудителей болезней, вступивших в серологическую реакцию со специфическим антителом, окрашенным (меченным) изотиоцианатом флуоресцеина (флуорохромом). Специфические антитела к возбудителю какой-либо болезни получают из специфической сыворотки путем высаливания из нее глобулина сернокислым аммонием. Очищенный от соли путем диализа глобулин, содержащий антитела, окрашивают красителем изотиоцианатом флуоресцеина и лиофильно высушивают. Мазки из тканей больных или погибших насекомых, сделанные на чистом, обеззараженном предметном стекле, фиксированные ацетоном, обрабатывают окрашенным (меченым) глобулином в разведении 1:2 и исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа. При наличии в мазках из тканей специфического к меченым антителам антигена последний приобретает свечение различной четкости и окраски.

 

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *